Real-Time PCR

Dicetuskan pertama kali oleh Kary Mullis di tahun 1984, Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu jenis eksperimen yang sudah sangat umum dilakukan dalam ranah biologi molekuler. Berdasar pada kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis untai DNA baru dari  template yang tersedia, PCR banyak digunakan dalam analisis molekuler terutama untuk memperbanyak region (amplikon) yang diinginkan hingga mendeteksi adanya gen tertentu pada suatu sampel.

Real time PCR

Real time PCR atau quantitative real time PCR (qPCR) merupakan salah satu metode PCR yang kini sudah banyak diaplikasikan dalam biologi molekuler. Pada metode qPCR, peneliti tidak hanya dapat mendeteksi keberadaan suatu gen tertentu tetapi juga mengetahui kuantitas gen target pada sampel hingga membandingkan ekspresi gen pada sampel.

Apa perbedaan proses PCR konvensional dan qPCR?

Sama dengan PCR biasa atau PCR konvensional, konsep PCR pada qPCR berdasar pada kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis DNA dari template yang tersedia. Yang membedakan adalah bagaimana data hasil amplifikasi dapat dianalisis oleh peneliti. Sebagai contoh, pada PCR konvensional setelah proses termal (denaturasi, annealing/penempelan, dan elongasi) selesai, biasanya produk PCR akan diproses lebih lanjut menggunakan gel elektroforesis dan kemudian akan muncul band produk yang dapat dibandingkan dengan band kontrol atau standar.

Pada qPCR, peneliti dapat mengobservasi proses akumulasi produk PCR bersamaan dengan terjadinya proses amplifikasi sehingga ketika alat selesai bekerja, data hasil amplifikasi dapat langsung dianalisis. Hal ini tentunya mempersingkat waktu eksperimen dan mengurangi kemungkinan terjadinya kontaminasi karena meniadakan proses gel elektroforesis. Fluoresens yang terdapat pada reagent PCR juga memungkinkan keseluruhan proses amplifikasi terbaca, berbeda dengan jenis endpoint PCR dimana hanya hasil akhir amplifikasi saja yang dapat diketahui.

Aplikasi dan penggunaan qPCR

Ada dua jenis qPCR yang sering digunakan dalam penelitian biologi molekuler yaitu kuantifikasi absolut dan kuantifikasi relatif. Kuantifikasi absolut mengacu pada jenis analisis dimana peneliti ingin mengetahui kuantitas atau banyaknya gen yang diteliti dalam sampel. Sebagai contoh, peneliti ingin mencari tahu berapa copy number gen parasit yang terdapat di sampel tumbuhan. Untuk mendapatkan jumlah absolut ini, peneliti diarahkan untuk membuat kurva standar menggunakan sampel yang sudah diketahui jumlahnya terlebih dahulu lalu kurva standar ini akan digunakan sebagai acuan untuk menghitung jumlah gen dalam sampel.

Sementara untuk kuantifikasi relatif lebih sering digunakan untuk menganalisis perbedaan fold pada ekspresi gen tertentu antara kelompok perlakuan yang berbeda. Misalnya, peneliti ingin mengetahui apakah ada perbedaan ekspresi gen yang berperan dalam sintesis lemak pada kelompok yang rajin sarapan dan yang tidak pernah sarapan. Jenis qPCR ini membutuhkan kontrol endogen atau sering disebut sebagai reference/housekeeping gene. Analisis data pada kuantifikasi relatif akan bergantung dari CT value yang dihasilkan oleh reference gene dan gen target.

Pengunaan qPCR dalam ranah biologi molekuler dan life science lainnya memungkinkan peneliti untuk memperoleh hasil yang akurat dan cepat. qPCR dapat menjadi pertimbangan Anda terutama jika penelitian Anda ingin mengetahui jumlah gen target atau membandingkan ekspresi gen antar perlakuan.

Referensi:

Integrated DNA Technologies. (2011). qPCR Application Guide; Experimental Overview, Protocol, Troubleshooting.

National Center for Biotechnology Information. (2017, November 09). Retrieved January 21, 2020, from Polymerase Chain Reaction: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/