GET TO KNOW GENE EXPRESSION ANALYSIS

by Nisrina Thufailah Hakim & Owen Distyan Pusponegoro | Feb, 23, 2023

GET TO KNOW GENE EXPRESSION ANALYSIS

Apa Itu Gene Expression?

Ada banyak studi eksperimen yang dirancang untuk menguji hipotesis mengenai adanya perbedaan ekspresi gen antara kelompok subjek biologis yang terpapar kondisi dan/atau perlakuan berbeda.  Studi ini disebut studi ekspresi gen (gene expression). Studi ekspresi gen pada level RNA memungkinkan peneliti menyelidiki perubahan ekspresi gen pada tingkat RNA hingga mengukur kelimpahan transkrip suatu kumpulan gen tertentu.

Langkah kerja studi ekspresi gen terdiri dari pengambilan sampel bahan biologis, ekstraksi RNA, reverse transcription (RT) sampel RNA menjadi DNA komplementer (cDNA), profiling dan kuantifikasi ekspresi gen, serta analisis data profil ekspresi gen.  [1]

Aplikasi Studi Ekspresi Gen

  • Mengidentifikasi level ekspresi gen terkait Imuno-Onkologi dan penyakit neurodegeneratif;
  • Ekspresi gen pada tanaman yang terserang penyakit;
  • Validasi hasil NGS dan Microarray;
  • Analisis biomarka
  • Pathway analysis

Tiga Teknik Umum Untuk Studi Ekspresi Gen

Gambar 1. Northen Blotting.
Image source : https://commons.wikimedia.org/

Northen Blotting

Prinsip dasar Northern blotting adalah RNA dipisahkan berdasarkan ukuran (menggunakan elektroforesis gel agarosa), kemudian ditransfer (blotting) ke dalam membran nilon, dan dideteksi pada membran menggunakan hybridization probe yang komplementer dengan seluruh atau sebagian urutan mRNA target. [2] Kompleks probe RNA dapat dideteksi baik melalui pendekatan radioaktif atau non-radioaktif. Sebagian besar laboratorium menggunakan pendekatan radio aktif yaitu  probe diberi label dengan 32P (atau 33P). Ada beberapa keuntungan menggunakan probe berlabel radio aktif diantaranya yaitu prosedurnya sudah lama ditetapkan, robust, dan tingkat sensitivitasnya yang tinggi. Sementara itu, pendekatan non-radioaktif yang paling banyak digunakan didasarkan pada chemiluminescence. [3] Teknik Nothern blotting ini adalah teknik pertama yang digunakan untuk mengukur ekspresi gen pada tingkat RNA.

Microarray

Microarray adalah teknik yang digunakan untuk mengukur ekspresi ribuan gen secara bersamaan. Teknik ini menggunakan slide mikroskop berisi ribuan titik kecil yang mengandung sekuens DNA atau gen yang sudah diketahui. Slide ini disebut DNA chip. Masing-masing sekuens DNA atau  gen tersebut menempati titik yang berbeda di dalam slide.  Sekuens DNA pada masing-masing slide berfungsi sebagai ‘probe’ untuk mendeteksi ekspresi gen dari sampel transcriptome yang Anda miliki.

Gambar 2.  Microarray.
Image Source: https://ib.bioninja.com.au

Untuk melakukan analisis microarray, molekul mRNA biasanya dikumpulkan dari sampel dengan kondisi yang berbeda. Misalnya,’sampel referensi’ dikumpulkan dari individu yang sehat, dan ‘sampel eksperimental’ dikumpulkan dari individu yang menderita penyakit seperti kanker. Dua sampel mRNA kemudian diubah menjadi cDNA, dan masing-masing sampel diberi label dengan probe fluoresen dengan warna berbeda. Misalnya, sampel cDNA eksperimental dapat diberi label dengan pewarna fluoresen merah, sedangkan cDNA referensi dapat diberi label dengan pewarna fluoresen hijau [4]. Kedua sampel kemudian dicampur bersama dan dibiarkan mengikat ke slide microarray. Proses di mana molekul cDNA berikatan dengan probe DNA pada slide disebut hibridisasi. Setelah hibridisasi, microarray dipindai untuk mengukur ekspresi setiap gen pada slide. Jika ekspresi gen tertentu lebih tinggi pada sampel eksperimental  daripada sampel referensi, maka titik yang sesuai pada microarray tampak merah. Jika sebaliknya, maka titik tersebut tampak hijau. Adapun, jika ada ekspresi yang sama pada kedua sampel, maka titik tersebut tampak kuning [4]

Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

Gambar 3. Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR).
Image source : Quan et al. (2018)

Reverse transcription quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) merupakan teknik studi ekspresi gen yang juara dalam hal akurasi, sensitivitas, dan hasil yang cepat. Karena itu, teknik ini masih menjadi gold-standard untuk analisis ekspresi gen medium-throughput 6

Prinsip kerja RT-qPCR yakni mRNA ditranskripsi balik (reverse transcripted) menjadi cDNA kemudian diikuti oleh amplifikasi menggunakan instrumentasi qPCR. Jumlah setiap target spesifik ditentukan dengan mengukur peningkatan sinyal fluoresensi dari pewarna (dyes) atau probe selama siklus amplifikasi yang dimediasi oleh enzim polimerase [6]. RT-qPCR dapat dimanfaatkan untuk menyelidiki mutasi (termasuk insertion, deletion, dan polimorfisme nukleotida tunggal (SNP)), mengidentifikasi modifikasi DNA (seperti metilasi), mengkonfirmasi hasil microarray, dan melakukan profil ekspresi gen. Tingkat ekspresi suatu gen dapat diukur relatif terhadap gen lain (kuantifikasi relatif) atau terhadap kurva standar (kuantifikasi absolut) [2,5,6]. Meski begitu, kuantifikasi relatif merupakan metode analisis yang lebih umum digunakan untuk studi ekspresi gen menggunakan RT-qPCR.

SUMBER PUSTAKA

  1. Tichopad A, Didier A, Pfaffl MW. Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue-specific contaminants. Mol Cell Probes. 2004 Feb;18(1):45-50. doi: 10.1016/j.mcp.2003.09.001.
  2. Bio-Rad Laboratories. “What is Gene Expression Analysis?” https://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/what-gene-expression-analysis?ID=LUSNINKSY, accessed April 12th, 2023
  3. Trayhurn P. Northern blotting. Proc Nutr Soc. 1996 Mar;55(1B):583-9. doi: 10.1079/pns19960051.
  4. Scitable by Nature Education. (n.d.). “Microarray”https://www.nature.com/scitable/definition/microarray-202/#:~:text=A%20microarray%20is%20a%20laboratory,known%20DNA%20sequence%20or%20gene, accessed April 12th, 2023
  5. Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J.How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods, 2010, :50(4):227-230,DOI : https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.11.001.
  6. Heather D. VanGuilder, Kent E. Vrana, and Willard M. Freeman. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques 2008 44:5, 619-626

GENETIKA SCIENCE MENYEDIAKAN TRANSCIPTOME SEQUENCING