by Nurina Indirayati & Owen Distyan Pusponegoro | August 1, 2024

Apa yang dimaksud dengan ELISA?

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) merupakan metode yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur protein spesifik dalam suatu campuran kompleks. Metode ini pertama kali dicetuskan oleh Engvall dan Perlmann (1971), yang memungkinkan analisis sampel protein yang diimobilisasi dalam sumuran lempeng mikro menggunakan antibodi spesifik, sebagai pengganti dari radioimmunoassay.

Untuk mendeteksi molekul-molekul ini, antigen atau antibodi diberi label menggunakan enzim yang spesifik terhadap molekul yang dideteksi, sehingga metode ini disebut sebagai enzyme immunoassay, dimana alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP), dan beta-galactosidase umum digunakan sebagai label reporter.

ELISA memungkinkan analisis kuantitatif maupun kualitatif dari antigen yang sangat sensitif dan selektif, termasuk protein, peptide, asam nuklat, hormon, herbisida, dan metabolit sekunder dari tanaman. Pada teknik ELISA, antigen dalam fasa cair diimobilisasi pada fase padat, seperti microplate, kemudian antigen dibiarkan bereaksi dengan antibodi spesifik, yang kemudian dideteksi oleh antibodi sekunder yang berlabel enzim. Perubahan warna oleh substrat kromogenik akan menunjukkan keberadaan antigen. Reaksi antara enzim dan substrat ini akan berlangsung dalam kurun waktu 30 – 60 menit, untuk kemudian reaksi dihentikan dengan menggunakan larutan penghenti (stop solution), terbentuk kemudian menghasilkan kompleks enzim-substrat yang dapat dideteksi melalui warna, fluoresensi, dan luminesensi.

Antibodi penangkap yang secara khusus mengikat sampel yang akan dianalisis diimobilisasi pada microplate, untuk mengikat dan menangkap analit (biru) pada microplate. Antibodi sekunder (merah) yang juga mengikat analit membawa enzim (kuning). Substrat ditambahkan (abu-abu) yang diubah oleh enzim menjadi kromofor atau fluorofor. Semakin banyak analit yang ditemukan dalam sampel, semakin banyak enzim yang terikat, dan semakin banyak substrat yang diubah. Oleh karena itu, intensitas sinyal berkorelasi dengan konsentrasi analit.

Direct ELISA

Pada metode Direct ELISA, dua langkah pengerjaan dilakukan tanpa prosedur washing dan blocking. Pertama, molekul yang akan dianalisis ditempatkan pada permukaan microplate. Kemudian, antibodi primer yang berlabel enzim ditambahkan. Setelah itu, substrat dan agen penghenti ditambahkan, dan kompleks warna yang terbentuk dapat dideteksi. Perlu dicatat bahwa pengujian memerlukan sampel murni untuk menghindari interferensi dari protein lain, dan tidak semua antibodi primer dapat berlabel enzim.

Indirect ELISA

Pada metode Indirect ELISA, dua langkah pengerjaan dilakukan, mirip dengan Direct ELISA. Perbedaan dari dua metode tersebut terletak pada penggunaan antibodi sekunder yang berlabel enzim. Dalam Indirect ELISA, antigen terlebih dahulu diimobilisasi pada microplate, lalu antibodi primer mengikat antigen tersebut. Selanjutnya, antibodi sekunder yang berlabel enzim akan berikatan dengan antibodi primer, dan kompleks warna terbentuk. Sinyal akan semakin kuat seiring dengan peningkatan jumlah antigen target yang diimobilisasi. Metode ini sangat berguna untuk mengukur makromolekul.

Sandwich ELISA

Sesuai dengan namanya, ‘sandwich’, pada metode antigen target diapit diantara antibodi primer dan antibodi sekunder dari kedua sisi. Metode ini membutuhkan antibodi yang cocok antara capture antibody dan detection antibody, untuk memastikan kedua antibodi ini mendeteksi epitope yang berbeda untuk memperoleh hasil ELISA yang akurat. Strategi ini memberikan kontrol yang baik terhadap spesifisitas uji karena molekul yang akan diimobilisasi pertama (antibodi primer) dapat dimurnikan secara intensif. Namun apabila molekul target yang akan diamati tidak berinteraksi dengan antibodi primer, ada kemungkinan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer dan menghasilkan positif palsu.

Competitive ELISA

Metode ini juga biasa disebut sebagai blocking ELISA dan merupakan metode ELISA yang kompleks dibandingkan dengan metode ELISA yang lainnya. Dalam metode ini, antigen sampel bersaing dengan antigen referensi untuk berikatan dengan antibodi berlabel yang terbatas jumlahnya. Semakin tinggi konsentrasi dari antigen sampel, sinyal akhir yang dihasilkan semakin lemah.  Dalam protokol ini, dua set pengujian dilakukan secara paralel. Pengujian pertama dilakukan dengan prosedur Indirect ELISA. Kemudian secara terpisah dilakukan prosedur pengikatan dan inkubasi antara antibodi primer dengan antigen target. Selama proses inkubasi berlangsung, akan ada antigen yang tidak berikatan dengan antibodi primer. Kemudian kompleks antibodi primer dan antigen yang telah diinkubasi ditambahkan pada well plate yang telah dilapisi oleh antigen, dan akan ada kesempatan lagi bagi antibodi primer untuk berikatan dengan antigen. Pengujian ini memberikan hasil deteksi yang komparatif. Sinyal yang diterima dari antibodi yang sudah terikat sebelumnya berbanding terbalik dengan keberadaan analit yang diinginkan dan memberikan tingkat spesifisitas yang tinggi.

Metode Deteksi Pada ELISA

Deteksi ELISA dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metode antara lain, kolorimetri, fluoresensi, dan luminesensi. Metode deteksi kolorimetri menghasilkan produk reaksi berwarna yang mampu menyerap cahaya dalam rentang terlihat (visible UV). Adanya dari biomolekul target dapat dikonfirmasi dengan mata telanjang. Metode deteksi dalam ELISA yang lainnya adalah berbasis fluoresensi. Pada metode ini, enzim konjugasi mengubah substrat menjadi bentuk akhir produk yang disebut dengan fluorofor.

Fluorofor kemudian tereksitasi dengan cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan memancarkan fluoresensi. Sedangkan pada deteksi berbasis luminesensi, enzim mengubah substrat menjadi produk reaksi yang memancarkan foton cahaya. Berikut ini adalah gambaran perbedaan dari tiga metode yang ada ditinjau dari berbagai faktor.