IDT Oligo

Sebagai salah satu faktor utama dalam PCR, oligonucleotides atau biasa disebut primer, membutuhkan penanganan tersendiri agar kualitasnya tetap terjaga terutama untuk penggunaan jangka panjang. Beberapa hal yang harus dipersiapkan sebelum mulai bekerja dengan oligo adalah mesin spin-down, TE buffer, Nuclease Free Water (NFW), serta acuan konsentrasi yang diinginkan untuk pengerjaan PCR.

Oligo yang akan Anda terima dikirim dalam suhu ruang dan berbentuk kering seperti flake berwarna putih. Oligo dalam bentuk ini cukup stabil dan dapat disimpan di suhu ruang untuk beberapa waktu namun sebaiknya segera resuspensi oligo tidak lama setelah diterima atau simpan oligo kering tersebut setidaknya pada suhu 4 derajat celcius, karena menyimpan oligo dalam bentuk kering di suhu ruang terlalu lama dapat  mempengaruhi kualitas DNA oligo.

Resuspensi

Sebelum resuspensi, hal pertama yang sebaiknya dilakukan adalah spin down tube oligo. Hal ini bertujuan untuk memastikan oligo yang menempel di dinding atau tutup tube dapat turun ke dasar tube. Selanjutnya oligo diresuspensi menggunakan TE buffer, dimana tris pada TE buffer dapat membantu menjaga kestabilan pH oligo, sementara EDTA dapat menghambat nuclease digestion pada DNA. Kedua komponen ini menjadikan TE buffer sebagai medium yang ideal untuk menyimpan oligo dalam jangka waktu lama. Sebagai alternatif, NFW dengan pH 7.0 dapat juga digunakan untuk meresuspensi oligo, namun penggunaan NFW tidak dapat membantu menjaga kestabilan pH sebaik TE buffer, terutama  jika oligo disimpan dalam jangka waktu yang panjang. Jenis pelarut yang kurang disarankan untuk resuspensi oligo adalah DEPC water karena dapat mendegradasi DNA oligo selama penyimpanan.

Untuk konsentrasi resuspensi yang disarankan adalah tidak kurang dari 1 µM dan tidak lebih dari 10 mM. Konsentrasi optimum yang disarankan adalah 100 µM. Cara menghitung volume TE buffer yang harus ditambahkan untuk mendapatkan master stock 100 µM adalah mengalikan jumlah nanomole (nmol) dari oligo tersebut dengan 10. Sebagai contoh, jika pada specification sheet  tertera jumlah nanomole dari oligo adalah 20.3 nmol maka untuk mendapatkan konsentrasi 100 µM dapat ditambahkan 203 µL TE buffer.

Pengenceran

Dari master stock dengan konsentrasi 100 µM tersebut, Anda dapat mengencerkannya lagi menjadi working stock sesuai dengan acuan konsentrasi yang dibutuhkan untuk PCR. Pengenceran dari master stock ke working stock ini dapat menggunakan NFW.

Sebagai contoh, jika Anda membutuhkan 100 µL working stock dengan konsentrasi 100 µM, maka Anda dapat melakukan pengenceran 1:10, yaitu melarutkan 10 µL dari master stock dengan 90 µL NFW sehingga didapatkan working stock dengan konsentrasi 10 µM dan volume sebesar 100 µL. Selama pengerjaan baik resuspensi dan pengenceran, selalu spin down tube sebelum digunakan agar oligo tetap homogen dan tidak menempel di dinding atau tutup tube.

Penyimpanan

Cara menyimpan oligo merupakan faktor penting yang dapat mempengaruhi kualitas dan stabilitas oligo. Suhu optimum yang disarankan untuk penyimpanan adalah -20 derajat celcius, oligo yang disimpan di suhu ini biasanya stabil hingga 2 tahun. Selama penyimpanan, freeze-thawing yang terlalu sering sebaiknya juga dihindari untuk menjaga kualitas oligo. Maka dari itu sebaiknya oligo disimpan dalam aliquot sesuai dengan kebutuhan PCR Anda untuk mencegah freeze-thawing berulang serta untuk meminimalisir kemungkinan terjadinya kontaminasi.

Sumber:

Speicher, N. (2017, June 20). Storing oligos: 7 things you should know. Retrieved October 2, 2020, from Integrated DNA Technologies: https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/storing-oligos-7-things-you-should-know

Wagner, E. (2014, January 14). My oligos have arrived: Now what? Retrieved October 2, 2020, from Integrated DNA Technologies: https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/my-oligos-have-arrived-now-what