Over-Passaging pada Cell Line : Risiko Tersembunyi & Strategi Start Over

Dalam banyak laboratorium, penggunaan cell line passage tinggi sebenarnya bukan sesuatu yang disengaja. Banyak peneliti menyadari bahwa terlalu banyak passaging dapat mempengaruhi kualitas kultur dan hasil eksperimen. Masalahnya, stok sel yang tersedia sering kali memang sudah berada pada passage yang tinggi sejak awal. Kultur kemudian terus dipertahankan karena masih terlihat “baik-baik saja”. Sel masih dapat attach, masih bisa tumbuh dan konfluen, serta tidak terlihat adanya tanda kontaminasi. Karena itu, kultur tetap di-passage dari minggu ke minggu, bahkan berbulan-bulan, tanpa benar-benar dilakukan pengujian dan autentikasi terkait karakteristik sel.

Situasi ini cukup umum terjadi, terutama ketika laboratorium tidak memiliki stok cadangan dengan passage rendah, tidak ada riwayat pencatatan nomor passage yang lengkap, atau menggunakan kultur yang sudah lama diwariskan antar anggota laboratorium. Dalam beberapa kasus, peneliti bahkan tidak mengetahui secara pasti sudah berapa lama cell line tersebut dipelihara atau apakah karakteristik biologisnya belum berubah.

Berbeda dengan kontaminasi mikroorganisme seperti bakteri yang dapat langsung dikenali dari media keruh atau perubahan warna media kultur, over-passaging tidak memberikan “alarm” yang jelas. Yang membuat situasi ini semakin sulit adalah tidak adanya metode universal yang dapat secara langsung digunakan untuk mendeteksi umur biologis atau kondisi passage suatu cell line [1]. Dokumentasi mengenai nomor passage sel pun masih sangat bergantung pada metode pencatatan manual selama proses kultur berlangsung. Maka dari itu, ketika pencatatan tidak dilakukan secara rutin dan konsisten, peneliti berisiko kehilangan jejak mengenai seberapa tinggi nomor passage yang telah dimiliki suatu kultur sel.

Ketika dikultur dalam jangka panjang, sel semacam ‘dipaksa’ untuk beradaptasi pada lingkungan in vitro yang ada. Kebanyakan bentuk adaptasi sel ini terjadi dalam bentuk perubahan ekspresi protein seluler. Pada beberapa cell line, terutama yang mengalami proses imortalisasi atau rekayasa genetik, sel dipaksa untuk mengekspresikan protein asing yang secara alami tidak diekspresikan oleh sel tersebut. Proses ekspresi protein asing ini memerlukan energi yang besar dari sel. Akibatnya, energi yang seharusnya digunakan untuk pertumbuhan serta proliferasi sel menjadi terbagi dan laju pertumbuhan sel dapat menurun dibanding kondisi normal [1].

Seiring waktu, kondisi ini dapat memicu terjadinya seleksi alami di dalam populasi sel. Sebagian kecil subpopulasi mungkin mulai menurunkan tingkat ekspresi protein, atau bahkan berhenti mengekspresikannya sama sekali. Karena tidak lagi mengalokasikan energi untuk produksi protein tambahan, subpopulasi ini dapat tumbuh lebih cepat dibanding populasi awal. Dalam kultur jangka panjang, sel-sel dengan pertumbuhan lebih cepat tersebut perlahan akan mendominasi populasi kultur [1] . Hal inilah yang menyebabkan cell line dengan passage tinggi sering kali menunjukkan karakteristik biologis yang berbeda dibandingkan generasi kultur yang lebih awal. 

Masalahnya, efek dari over-passaging ini sering kali baru disadari ketika sudah muncul perbedaan yang cukup signifikan, seperti perubahan morfologi sel, growth rate yang tidak stabil, atau hasil eksperimen yang mulai tidak konsisten. Sayangnya, munculnya tanda-tanda tersebut sering menjadi indikasi bahwa sel telah mengalami perubahan genotipik dan fenotipik yang cukup jauh. Dengan kata lain, ketika perubahan tersebut mulai terlihat, kondisi kultur sebenarnya sudah terlambat untuk dikembalikan ke karakteristik awalnya.

Berbeda dengan kontaminasi mikroorganisme seperti bakteri yang dapat langsung dikenali dari media keruh atau perubahan warna media kultur, over-passaging tidak memberikan “alarm” yang jelas. Yang membuat situasi ini semakin sulit adalah tidak adanya metode universal yang dapat secara langsung digunakan untuk mendeteksi umur biologis atau kondisi passage suatu cell line [1]. Dokumentasi mengenai nomor passage sel pun masih sangat bergantung pada metode pencatatan manual selama proses kultur berlangsung. Maka dari itu, ketika pencatatan tidak dilakukan secara rutin dan konsisten, peneliti berisiko kehilangan jejak mengenai seberapa tinggi nomor passage yang telah dimiliki suatu kultur sel.

Ketika dikultur dalam jangka panjang, sel semacam ‘dipaksa’ untuk beradaptasi pada lingkungan in vitro yang ada. Kebanyakan bentuk adaptasi sel ini terjadi dalam bentuk perubahan ekspresi protein seluler. Pada beberapa cell line, terutama yang mengalami proses imortalisasi atau rekayasa genetik, sel dipaksa untuk mengekspresikan protein asing yang secara alami tidak diekspresikan oleh sel tersebut. Proses ekspresi protein asing ini memerlukan energi yang besar dari sel. Akibatnya, energi yang seharusnya digunakan untuk pertumbuhan serta proliferasi sel menjadi terbagi dan laju pertumbuhan sel dapat menurun dibanding kondisi normal [1].

Seiring waktu, kondisi ini dapat memicu terjadinya seleksi alami di dalam populasi sel. Sebagian kecil subpopulasi mungkin mulai menurunkan tingkat ekspresi protein, atau bahkan berhenti mengekspresikannya sama sekali. Karena tidak lagi mengalokasikan energi untuk produksi protein tambahan, subpopulasi ini dapat tumbuh lebih cepat dibanding populasi awal. Dalam kultur jangka panjang, sel-sel dengan pertumbuhan lebih cepat tersebut perlahan akan mendominasi populasi kultur [1] . Hal inilah yang menyebabkan cell line dengan passage tinggi sering kali menunjukkan karakteristik biologis yang berbeda dibandingkan generasi kultur yang lebih awal. 

Masalahnya, efek dari over-passaging ini sering kali baru disadari ketika sudah muncul perbedaan yang cukup signifikan, seperti perubahan morfologi sel, growth rate yang tidak stabil, atau hasil eksperimen yang mulai tidak konsisten. Sayangnya, munculnya tanda-tanda tersebut sering menjadi indikasi bahwa sel telah mengalami perubahan genotipik dan fenotipik yang cukup jauh. Dengan kata lain, ketika perubahan tersebut mulai terlihat, kondisi kultur sebenarnya sudah terlambat untuk dikembalikan ke karakteristik awalnya.

Jadi, kapan waktunya kita harus start over?

Hingga saat ini, tidak ada angka spesifik terkait angka passage universal yang dapat digunakan sebagai “batas aman” untuk semua cell line. Setiap sel memiliki karakteristik, tingkat stabilitas, dan kemampuan adaptasi yang berbeda-beda. Nomor passage yang terlalu ‘tinggi’ bagi satu cell line, mungkin tidak berpengaruh signifikan terhadap cell line lain. Tingkat passage suatu cell line bergantung penuh pada tipe sel, asal jaringan dan spesies host, kondisi kultur, serta pengaplikasian sel tersebut [1]. 

Keputusan untuk memulai ulang kultur sebaiknya tidak hanya didasarkan pada nomor passage semata, tetapi juga pada konsistensi karakteristik biologis sel selama penelitian berlangsung. Ketika sel mulai menunjukkan perubahan morfologi, growth rate menjadi tidak stabil, respons terhadap treatment berubah, atau hasil eksperimen mulai sulit direproduksi, kondisi tersebut dapat menjadi tanda bahwa kultur sudah tidak lagi ideal untuk digunakan.

Masalahnya, masih banyak peneliti baru mulai mempertimbangkan untuk memulai ulang setelah eksperimen gagal atau data yang dihasilkan tidak lagi konsisten. Padahal, pada tahap tersebut perubahan biologis pada populasi sel kemungkinan sudah terjadi cukup jauh. Hal ini menyebabkan troubleshooting juga menjadi lebih sulit karena peneliti harus mengevaluasi ulang apakah masalah berasal dari protokol, reagen, kondisi kultur, atau justru dari cell line itu sendiri.

Dalam jangka panjang, kebanyakan peneliti juga kurang menyadari bahwa mempertahankan kultur yang sudah tidak stabil justru lebih mahal dibanding memulai ulang kultur dari stok yang lebih awal. Eksperimen yang harus diulang-ulang, penggunaan reagen tambahan, waktu troubleshooting, hingga keterlambatan penelitian dapat menghabiskan jauh lebih banyak sumber daya dibandingkan melakukan thawing dari stok passage rendah atau menggunakan cell line baru yang telah terautentikasi.

Memulai ulang kultur dengan strategi yang lebih baik

Melakukan start over bukan hanya berarti mengganti kultur lama dengan stok baru. Tanpa strategi pengelolaan kultur yang baik, masalah yang sama dapat kembali terulang setelah beberapa bulan penggunaan. Karena itu, menjaga konsistensi cell line sejak awal menjadi langkah penting untuk meminimalkan risiko perubahan karakteristik sel selama kultur berlangsung.

1. Memulai dengan sel yang telah terautentikasi

Langkah pertama yang paling penting adalah memastikan bahwa cell line yang digunakan berasal dari sumber yang terpercaya dan telah melalui proses autentikasi [1]. Menggunakan sel yang identitas dan kualitasnya tidak jelas dapat meningkatkan risiko terjadinya salah identifikasi, kontaminasi silang antar cell line, maupun variasi karakteristik biologis yang tidak diketahui sejak awal.

Selain itu, penggunaan stok dengan passage rendah juga menjadi faktor penting dalam menjaga kualitas kultur. Sel dengan passage rendah umumnya masih lebih dekat dengan karakteristik biologis aslinya dibanding kultur yang telah di-passage berkali-kali dalam jangka panjang. Karena itu, memulai kultur dari stok awal yang terautentikasi dapat membantu meningkatkan konsistensi dan reprodusibilitas hasil penelitian.

Saat ini terdapat berbagai repositori cell bank internasional yang menyediakan cell line terautentikasi untuk kebutuhan penelitian, salah satunya American Type Culture Collection (ATCC) yang menerapkan quality control dan standar internasional untuk memastikan identitas, keamanan, serta konsistensi cell line yang didistribusikan [2]. Dengan memulai kultur dari sumber yang terstandarisasi, peneliti dapat mengurangi risiko variasi biologis yang tidak diinginkan selama penelitian berlangsung.

2. Menerapkan sistem two-tiered cell banking

Salah satu strategi yang banyak digunakan untuk menjaga stabilitas kultur adalah penerapan sistem two-tiered cell banking. Sistem ini dilakukan dengan membagi penyimpanan sel menjadi Master Cell Bank (MCB) dan Working Cell Bank (WCB) [3]. Pendekatan ini membantu mengurangi risiko terjadinya genetic drift akibat kultur berkepanjangan serta menjaga konsistensi antar eksperimen dari waktu ke waktu. Di samping itu, sistem ini juga memudahkan peneliti untuk melacak riwayat kultur dan menjaga kualitas cell line yang digunakan di laboratorium.

Pada sistem ini, stok utama sel (MCB) disimpan pada passage rendah sebagai cadangan jangka panjang dan digunakan seminimal mungkin. Dari stok utama tersebut, peneliti kemudian membuat stok kerja (WCB) yang digunakan dalam eksperimen rutin dalam jumlah passage yang terbatas. Ketika kultur kerja mulai menunjukkan perubahan karakteristik atau telah mencapai batas passage tertentu, peneliti dapat kembali melakukan thawing menggunakan stok baru yang berasal dari stok utama (MCB).

Penyimpanan cell bank idealnya dilakukan menggunakan nitrogen cair pada suhu sekitar -150°C hingga -196°C [3]. Suhu ultra-rendah ini digunakan untuk menghentikan hampir seluruh aktivitas biologis dan metabolisme sel, sehingga kondisi sel tetap stabil selama penyimpanan jangka panjang. Meskipun dalam praktiknya masih banyak laboratorium yang berhasil menyimpan sel pada freezer dengan suhu –70°C hingga -90°C untuk tujuan jangka panjang, tidak berarti penyimpanan tersebut ideal. Pada suhu tersebut, aktivitas biologis residual sel masih dapat berlangsung secara perlahan dan menyebabkan akumulasi cellular damage seiring waktu [4]. Akibatnya, viabilitas dan kualitas kultur dapat menurun yang berujung pada penurunan tingkat recovery sel pasca thawing.

3. Melakukan monitoring secara rutin

Meskipun terlihat sehat secara visual, perubahan biologis pada cell line tetap dapat terjadi secara perlahan tanpa disadari. Karena itu, monitoring rutin menjadi langkah pencegahan yang penting agar perubahan pada kultur dapat dideteksi lebih awal sebelum mulai mempengaruhi hasil eksperimen secara signifikan.

Pengamatan morfologi

Morfologi sel merupakan indikator awal yang cukup sensitif terhadap perubahan kondisi kultur. Perubahan bentuk sel, pola pertumbuhan, tingkat adhesi, maupun tingkat konfluensi dapat menjadi tanda awal sel mengalami stres atau terkontaminasi.

Pemantauan growth rate

Perubahan laju proliferasi atau doubling time sering kali menjadi tanda awal bahwa karakteristik biologis sel mulai berubah. Pertumbuhan sel yang tiba-tiba menjadi lambat ataupun lebih cepat dapat mengindikasikan adanya perubahan karakteristik biologis dan populasi sel di dalam kultur [1].

Deteksi mikoplasma

Mikoplasma merupakan salah satu kontaminan yang paling sulit ditangani dalam kultur sel. Ukurannya yang kecil (±0,3–0,8 µm) serta tidak adanya dinding sel membuat mikoplasma mudah berkembang di dalam kultur tanpa terdeteksi secara visual. Selain itu, mikoplasma juga diketahui resisten terhadap banyak antibiotik dan dapat menyebar melalui aerosol atau sirkulasi udara di laboratorium [5]. Saat ini telah tersedia berbagai metode dan kit deteksi mikoplasma yang dapat digunakan secara rutin. Dengan melakukan pengujian berkala, misalnya setiap 5-10 kali passage, peneliti dapat mengidentifikasi kontaminasi lebih awal dan mencegah penggunaan kultur yang telah terkontaminasi dalam eksperimen.

Analisis ekspresi marker

Analisis ekspresi marker dilakukan untuk memastikan bahwa cell line masih mampu mengekspresikan protein tertentu dengan tingkat ekspresi yang sesuai. Pengujian ini penting terutama pada penelitian yang berhubungan dengan marker atau protein tertentu karena tingkat ekspresi dapat berubah seiring meningkatnya nomor passage. Evaluasi ini umumnya dilakukan menggunakan metode biokimia atau imunologi [6].

STR Profiling

Pada cell line manusia, Short Tandem Repeat (STR) profiling sering digunakan untuk memverifikasi identitas sel dan mendeteksi kemungkinan kontaminasi silang antar cell line. Pengujian ini penting terutama pada kultur yang digunakan dalam jangka panjang atau dipakai oleh banyak pengguna di laboratorium. STR profiling membantu memastikan bahwa sel yang digunakan masih sesuai dengan identitas awal dan valid untuk digunakan dalam penelitian.

Cell line mungkin tidak memiliki “masa pakai” yang tertulis secara pasti, tetapi setiap kultur tetap memiliki batas stabilitas biologisnya masing-masing. Ketika karakteristik sel mulai berubah dan hasil eksperimen tidak lagi konsisten, kondisi tersebut dapat menjadi tanda bahwa sudah waktunya untuk start over. Dalam banyak kasus, memulai ulang dari stok passage rendah justru menjadi langkah yang lebih efisien dibanding terus mempertahankan kultur yang kualitasnya sudah tidak lagi dapat dipastikan.

Daftar Pustaka

[1] Passage Number Effects In Cell Lines: Why they happen and what you can do about it. (2007). ATCC Technical Bulletin No. 7 

[2] Weiskirchen, S., Monteiro, A. M., Borojevic, R., & Weiskirchen, R. (2024). Unlocking potential: A comprehensive overview of cell culture banks and their impact on biomedical research. Cells, 13(22), 1861. 

[3] Seth, G. (2015). Recent advances in optimal cell banking of mammalian cells for biopharmaceutical production. Pharmaceutical Bioprocessing, 3(1), 35-43.

[4] Ryan, J. (2004). General Guide for Cryogenically Storing Animal Cell Cultures. Corning Life Sciences Technical Bulletin. www.corning.com/lifesciences.

[5] Nikfarjam, L., & Farzaneh, P. (2011). Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal (Yakhteh), 13(4), 203.

[6] Ryan, J. (2008). Introduction to Animal Cell Culture. Corning Life Sciences Technical Bulletin.

www.corning.com/lifesciences.